产品目录

本制品是由8条带状双链DNA条带组成的精准定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA条带大小和含量的分析。本DNA Ladder的8条带的大小分别为25、50、100、150、200、300、400、500bp。其中200bp条带为加亮带，含量为100ng/5μL，其余条带浓度为50ng/5μL。

本DNA Ladder适用于非变性的PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳，不适用于尿素PAGE电泳。由于片段较小，如使用琼脂糖分离，建议使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离。

• 制备凝胶
  
  • 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
    
  • 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    
    • 25bp DNA ladder适用于配制15%TBE-PAGE胶。
  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
    
  • 静置10～20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
    表一：TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于1mm厚度小板胶)
    

    最佳DNA分离范围	凝胶浓度	各成分用量(mL)
    		灭菌水	30% PAA(29:1)	5×TBE	10% APS	TEMED
    70～450bp	6%	3	1.0	1.0	0.05	0.005
    60～460bp	8%	2.66	1.34
    50～300bp	10%	2.33	1.67
    40～200bp	12%	2	2.0
    25～150bp	15%	0.5	2.5
    5～100bp	20%	0.66	3.34

  • 去除覆盖在分离胶上的乙醇；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    表二：TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL，适用于1mm厚度小板胶)
    

    凝胶浓度	灭菌水	30% PAA(29:1)	5×TBE	10%APS	TEMED
    4%	1mL	200μL	300μL	20μL	2μL

  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
    
  • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 电泳
  
  • 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液，1mL吸头冲洗加样孔1～2次。
    
  • 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样缓冲液，如5μL样品加1μL上样缓冲液，短暂离心后取5～10μL上样。25bp DNA ladder已经含有上样缓冲液，1mm厚10齿梳子直接上样5μL，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
    
  • 连接电源线，打开电源开关。200V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达距离凝胶下沿二分之一位置时结束电泳(~50bp)，此时溴酚蓝指示前沿在凝胶下沿边界(~17bp)。
    

    PAGE凝胶浓度	恒电压	起始电流	结束电流	二甲苯菁	溴酚蓝	电泳时间
    15%	200V	25～30 mA/板胶	10～18 mA/板胶	~50bp	~17bp	35+min

• 染色
  
  • 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3～5分钟。
    
  • 染色液配制：
    TBE-PAGE胶可以使用RealGood类染料后染染色，以下程序用RealGood Red红色核酸染料(货号：RFT232)进行染色。即用型染色液配制：
    

    成分	用量
    1×TBE	100mL
    RealGood Red核酸染料	10μL

  • 染色和观察：
    凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40～60rpm染色30分钟。紫外光或蓝光仪下观察。
    
    凝胶：15% T3.3C TBE-PAGE
    电泳条件：1×TBE 200V 35min电流变化：28～16mA
    染色：RealGood Red后染

• 琼脂糖凝胶制备
  由于片段较小，建议选用高分辨率琼脂糖制胶。以下步骤以制备50mL 3%凝胶为例：
  称取1.5g琼脂糖于玻璃三角瓶中，加入50mL 1×TAE，5μL RealGood Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混匀，盖好瓶盖，微波炉中火加热至沸腾，轻摇混匀，重复1～2次至琼脂糖完全溶解，无可见颗粒。倒入制胶容器中，插好梳子，常温凝固30～50分钟至凝胶完全凝固。
  
• 电泳
  
  • 取待测样品，加入相应体积6×DualColor DNA loading buffer，如10μL样品加2μL上样缓冲液，短暂离心后取5～10μL上样。25bp DNA ladder 1mm厚10齿梳子上样5μL，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
    
  • 建议电泳条件：凝胶浓度为3％，电泳电压8-10V/cm（单位电压指电泳槽阴阳极之间的距离电压，如阴极阳极之间的距离为20cm，可以用160～200 V电压进行稳压电泳），待溴酚蓝指示前沿距离凝胶末端2cm时终止电泳，电泳时间35～40分钟。
    

    琼脂糖浓度	电泳缓冲液	二甲苯菁	溴酚蓝	单位电压	电泳时间
    3%	1×TAE	~1000bp	~100bp	8～10V/cm	40min+
    	1×TBE	~700bp	~60bp	8～10V/cm	40min+

• 观察条带
  使用EB或Goldview染料时，由于染料本身带正电荷较多，随着电泳时间的延长，染料会向阴极聚集，导致小片段核酸结合的染料含量降低，会出现小片段的DNA片段紫外灯下亮度变弱或不可见。此时可以将胶浸泡于含有染料的电泳缓冲液中染色15～20分钟即可看到小片段。使用RealGood类染料可以直接观察条带。
  
• 实验示例
  
  3%琼脂糖凝胶
  电泳条件：1×TAE 150V 45min
  染色：RealGood Red后染